NEUROFIBROMATOSE

Em 1882, a Neurofibromatose, foi inicialmente identificada, na literatura médica, pelo Dr. Friedrich Von Recklinghausen, e desde aí ficou conhecida durante muitos anos como Doença de Von Recklinhausen. Era conhecida como a neurofibromatose periférica porque alguns dos seus sintomas - tumores e manchas na pele - pareciam limitar-se a afectar os nervos externos, ou melhor, o sistema nervoso periférico dos indivíduos. Este nome não é tecnicamente exacto porque, sabe-se hoje, que podem também aparecer tumores na sistema nervoso central na Neurofibromatose-Tipo 1 (NF1).

Nos últimos anos a investigação sobre esta doença tem aumentado. O "National Institute of Neurological Disorders and Stroke" (NINDS), dos E.U.A., tem como principal trabalho conduzir e promover pesquisas sobre doenças neurológicas.

Há alguns anos atrás, grupos de pesquisa do NINDS, localizou a posição exacta do gene NF1 no cromossoma 17. O gene NF1 foi clonado e a sua estrutura analisada. O produto do gene NF1 é uma grande e complexa proteína chamada neurofibrina. Uma porção desta proteína é semelhante à família das proteínas chamadas GAP (Guanosine Triphosfatase-activating Protein). Os cientistas demonstraram que estas proteínas GAP têm um papel muito significante na supressão dos tumores em certos câncros. As proteínas agem desviando a regular interacção e sequência do complexo químico do crescimento celular. A semelhança da proteína NF1 e as proteínas GAP sugere que, a proteína NF1 pode ter um papel de desvio semelhante no desenvolvimento dos neurofibromas. Os cientistas teorizam que estes defeitos no gene podem diminuir ou inibir a normal produção destas proteínas e permitir um crescimento celular irregular, o que pode levar ao desenvolvimento tumoral.

Neurofbromatose - Tipo 1 (NF1) é o nome dado a uma desordem genética clínica. Está caracterizada por manifestações proeminentes, tais como, manchas ou pontos "café-au-lait", de cor castanha, na pele, elélides e neurofibromas (tumores fibrosos moles que se desenvolvem a partir dos nervos) (FOTO 1) . Outras características incluem nóduls na íris de Lisch (FOTO2), displasia de ossos longos, glioma óptico e neurofibroma plexiforme.

FOTO 1
Os pontos "café-au-lait" são
manchas planas pigmentadas
na pele (lado superior direito)
e neurofibroma dermal (centro).
Os pontos "café-au-lait" foram assim
chamados, devido ao termo Francês para
designar café com leite evidenciando a sua
cor acastanhada

FOTO 2

Os nódulos de Lisch têm um crescimento

benigno pigmentado à volta da íris,

frequentemente em ambos os olhos.

Isto não interfere na visão

O cariótipo humano é constituido por 23 pares de cromossomas, recebendo um grupo de 23 cromossomas de cada um dos seus pais. Os cromossomas transportam os genes que deteminam as característcas indiiduais, como o sexo, estatura, cor dos olhos e cabelo, e os traços distintivos da família. Os genes estão ligados à produção de proeínas que controlam o desenvolvimento individual e a saúde. Se um gene herdado é efeituoso, ou se torna defeituoso espontaneamente, antes do nescmento, pode aparecer uma doença genética.

Cada criança de pais afectados pela NF tem 50% de chance de herdar o gene defeituoso e desenvolver NF. O tipo de NF herdada pela criança é sempre a mesma que afecta os pais (isto porque há 2 tipos de neurofibromatose, a NF1 e a NF2; este trabalho só se refere à NF1), contudo a intensidade da manifestação pode ser diferente de pessoa para pessoa da família.

A alteração genética que provoca a NF1 é considerada uma mutação autossómica dominante, mais comum na espécie humana, com taxa de mutação de 40 a 100 x 10 -6 e cerca de 50% dos pacientes apresenta mutação nova.

O estudo de famílias com Neurofibromatose - Tipo 1, levou à identificação do locus do gene NF1 na banda 1, região 1, do braço longo do cromossoma 17 (17q11). O produto do gene NF1 parece ser um componente do sinal de transdução, controlando a diferenciação celula. Mutação no gene NF1 levaria à redução da sua função, permitindo que células que deveriam diferenciar-se, escapem ao controlo e se continuem a reproduzir. Se o segundo alelo também sofre mutação, o crescimento celular ficará ainda mais descontrolado.

Gene

Local

Mutação Germinativa

Mutação Somática

NF1

17q11

Neurofibromatose - Tipo 1

Neuroblastoma

Melanoma Maligno

Câncro do Cólon

Por um lado vê-se que a NF pode ser herdada a partir dos pais, por outro lado pode surgir devido a uma mutação espontânea, não ligada aos pais. Assim, podemos afirmar que a NF pode aparecer em qualquer família. Dentro da mesma família podem-se observar extremas variabilidades de NF. O mesmo gene presente num diferente membro da mesma - irmãos e irmãs, avós, pais e filhos - pode resultar em casos de NF com muita variação de graus de intensidade e muitos sintomas diferentes de NF. Por exemplo, um pai que tenha uma NFsuave, pode ter um filho afectado gravemente pela doença. A situação contrária também pode ocorrer: um pai afectado gravemente, pode ter um filho com uma NF muito suave. Até ao presente não há maneira de predizer qual a intensidade com que qualquer pessoa pode ser afectada, em qualquer família com NF, ou que complicações de NF ela ou ele podem desenvolver.

A NF1 afecta aproximadamente 1 em cada 3500 pessoas em todo o mundo, afetando ambos os sexos, não tendo uma distribuição particular racial, geográfica ou étnica. Assim, conclui-se que toda a população mundial está em risco de ter NF1.

Para além das manifestações características da doença já enunciadas, a NF1 pode levar, ainda, ao desfiguramento, cegueira, surdez, deformações esqueléticas, tumores dermais, cerebrais e da espinal medula, perda de membros, doenças malignas e incapacidade de aprendizagem.

O gene NF1 tem estado implicado no desenvolvimento dos mais comuns e sérios cancros humanos, pois pode afectar nervos de todo o corpo e ocasionalmente podem desenvolver-se tumores no cérebro, nos nervos cranianos ou na espinal medula.

Figura 1 - Esquema que mostra a manifestações características da Neurofibromatose - Tipo 1

O modo mais fácil de descobrir se um indivíduo tem NF1 é tentar encontrar várias manchas "café-au-lait" - manchas lisas castanhas sobre a pele. Por vezes, aparecem logo após o nascimento, mas, mais frequentemente, podem aparecer nos primeiros meses de vida continuando, geralmente, a aumentar em número por um período de vários anos. As manchas castanhas "café-au-lait" em si mesmas são inofensivas e, em geral, não passam de meras "marcas de nascença". Não é por ter uma ou duas manchas acastanhadas que têm Neurofibromatose - Tipo 1.

Os indivíduos com Neurofibromatose - Tipo 1, frequentemente, têm muitas manchas "café-au-lait", por vezes centenas, e sempre mais de seis. As manchas têm até 5 mm de tamnho em indivíduos pré-puberes e mais de 12 mm após a puberdade. Isto não significa que haja ligação entre o número de manchas da pessoa e o grau de severidade da doença. Assim, a presença de múltiplas manchas "café-au-lait" somente sugere um diagnóstico da NF1, não provando a sua exisência. O diagnóstico da Neurofibromatose - Tipo1 só pode ser confirmada se outras características estiverem também presentes.

Outra característica da pele é a existência de efélides (sardas) debaixo dos braços (axilas) ou na zona das virilhas, Há pessoas que apresentam efélides nas partes do coerpo expostas à luz solar, mas nos indivíduos com NF1 aparecem efélides em áreas do corpo não esxpostas ao sol. Estas efélides são inofensivas, mas podem ajudar a diagnosticar a NF1.

Os neurofibromas, pequenos crescimentos celulares originados por cima da cobertura que circunda os nervos, são frequentemente, detectados como pequenos inchaços na pele. A maioria dos neurofibromas da pele são pequenos, desde o tamanho da cabeça de um alfinete até ao tamanho da borracha de um lápis. Estes podem aparecer em qualquer lugar da pele, em qualquer altura da vida. Não servem para prever o número de neurofibromas que os indivíduos com NF1 podem vir a ter. Na maioria das pessoas só aparecem 1 ou 2, mas noutras podem aparecer muito mais. Os neurofibromas não aparecem somente na superfície da pele, podem também aparecer em qualquer local do corpo, onde existam nervos. Por vezes os neurofibromas podem apalpar-se e são semelhantes a ervilhas ou inchaços debaixo da pele. Outros podem ser tão profundos no corpo que a pessoa com NF1 é desconhecedora da sua existência. Os neurofibromas dermais são frequentemente suaves e sem dor.

A observação de todas as características da doença envolve um cuidadoso exame físico, incluindo um exame aos olhos, num oftalmologista. O diagnóstico da NF1 é considerado estabelecido em qualquer pessoa desde que tenha duas das caractrísticas da lista que se segue:

Por exemplo, a criança com mais de seis manchas cor de café com leite que também tem nódulos de Lisch, pode ser considerada afectada.

O diagnóstico da NF1 é baseado, actualmente, nos critérios clinicos recomendados por uma conferência de concenso do NIH (National Institutes of Health - uma unidade do Governo Federal dos E.U.A.) em 1987.

Seguidamente, podem observar-se fotos que demonstram diferentes aspectos visíveis de Neurofibromatose-Tipo1.

Ainda não há cura para a NF1. O tratamento passa por um controlo dos sintomas. O diagnóstico precoce, a vida que levam e a cirurgia, são a protecção preliminar para o paciente com NF1. O diagnóstico precoce é, assim, especicialmente importante, embora nem sempre possível, porque fornece uma oportunidade de detectar cedo complicações e de oferecer o tratamento apropriado.

O teste genético é vantajoso para famílias com casos documentados de NF1. As análises genéticas podem ser usadas para confirmar diagnósticos clínicos se a doença for o resultado de herança familiar. Novas (espontâneas) mutações não podem ser confirmadas geneticamente. O diagnóstico pré-natal, para famílias com NF1, é possível utilizando o método da amniocentese ou amostragem de vilosidades coriónicas. Conselheiros genéticos podem, também, providenciar informação àcerca destes processos e servirem de guias aos indivíduos com NF1.

Até agora, o diagnóstico indirecto do DNA, pela análise ligada ao polimorfismo genético, só foi possível em determinadas famílias com vários indivíduos afectados. Estes testes indirectos não são tão exactos quanto o diagnóstico directo, devido à possível recombinação entre os marcadores genéticos e a mutação NF1. Para além disso, são caros e requerem a disponibilidade e cooperação dos familiares. Estes estudos não são possíveis quando há somente um indivíduo afectado na família.

As perspectivas para os testes moleculares directos, pela a análise da mutação, foram limitados devido às poucas mutações identificadas no gene NF1 e devido, também, à baixa frequência destas mutações.

O gene NF1, situado no cromossoma humano 17, mede aproximadamente 350 Kilobases (Kb) do DNA genómico. A sua cópia de 12 Kb contém aproximadamente 59 exons (regiões codificantes). O grande tamanho do gene e as técnicas, relativamente insensitivas e muito trabalhosas, usadas na detecção das causas da mutação, produziram relativamente poucas mutações, desde a altura em que o gene começou a ser clonado, em 1990, até recentemente.

Os investigadores que procuraram no DNA de mais de 500 pacientes, não relacionados com o NF1, definiram somente cerca de 5-15% de todas as mutações, durante este tempo.

O teste do truncamento da proteína é uma nova tecnologia molecular. Este é usado para identificar proteínas encurtadas (i.e., truncadas) produzidas in vitro e originadas a partir de alelos mutantes que possuem certas mutações causadoras de doenças.

Estas mutações "truncadas" incluem mutações absurdas e alterações na estrutura o que resulta em sinais prematuros da terminação da tradução, bem como grandes delecções na estrutura. O ensaio foi usado com sucesso para detectar mutações no gene "dystrophin" alterado na Distrofia Muscular de Duchene e mais recentemente no gene BRCA1, alterado no cancro da mama e/ou cancro dos ovários. Tem, agora, vindo a ser aplicado ao gene NF1, porque a maioria das mutações conhecidas são cadeias terminais.

O teste é baseado num relatório feito por Sarker e por Smmer, que desenvolveram uma técnica em que o Rt-PCR, poderia ser usado para produzir cópias de RNAm em séries. Primeiro o DNA é preparado por transcrição reversa do RNA total da célula, seguida de ampliações, usando a reacção em cadeia de polimerase (RT-PCR). O primer mais à frente de cada par primer, contém as sequências mais apropriadas para a transcrição e tradução, isto é, o bacteriófago promotor T7 e os sinais eucarióticos da iniciação da tradução da forma de cada cadeia de cDNA, representa um único código. Os polipeptídeos radioactivos são sintetizados in vitro, originados a partir do cDNA e fraccionados pelo "sodium-dodecyl-sulfate-polyacrylamide gel electroforesis" (SDS-PAGE), sendo, depois sujeitos à auto-radiografia. Nos pacientes a mutação é indicada pela presença de uma nova banda, de peso molecular mais baixo, que representa um polipeptídeo truncado.

Recentemente, o ensaio do truncamento das proteínas tem vindo a ser aplicado com sucesso no gene NF1 de 20 pacientes com casos familiares ou esporádicos de NF1 diagnosticados clinicamente e a um paciente somente com manchas cor de café com leite, sem outras características de NF1. Treze mutações, inéditas anteriormente, foram caracterizadas, pela sequência de DNA, depois de observação dos polipeptídeos truncados, em catorze destes indivíduos. Uma destas mutações foi encontrada numa criança com uma só característica dos critérios do diagnóstico.

Sendo a taxa de detecção de 65% (13/20 pacientes que foram diagnosticados pelos critérios do NIH) constitui um significante progresso na taxa de detecção qua vigora até à data.

O desenvolvimento do teste do truncamento da proteína é um eficiente e efectivo método de descoberta para amutação no gene NF1, sendo um poderoso instrumento de trabalho. Por exemplo, o teste permite estudar todo o código da região NF1, em cada indivíduo analisado, o que tem permitido que a destribuição das mutações NF1 fossem descobertas pela primeira vez. As 13 mutações, identificadas por este meio, não mostram tendência para se agruparem em "hotspots" mutacionais.

O uso destes testes é próprio para acelerar a taxa de identificação das mutações NF1, facilitando, consequentemente, o estudo do efeito das mutações específicas na estrutura e funcionamento do produto do gene NF1, bem como o estudo da correlação entre o genótipo e o fenótipo.

Isto também servirá para no futuro delinear o fenótipo da do NF1. Interesse particular têm os indivíduos com características isoladas de NF1 que não vão de encontro aos critérios estabelecidos pelo NIH, alguns dos quais podem ser portadores de mutações NF1.

O teste do truncamento da proteína tem grande potencial para vir a ser usado como diagnóstico directo ou teste pré-sintomático na Neurofibromatose-Tipo1.

Ao contrário de outras abordagens, este apenas identifica fenotipicamente mutações significativas, eliminando a necessidade de distinguir entre o DNA polimórfico e mutações patogénicas.

As suas vantagens, no panorama clínico, inclui, também, a capacidade de usar qualquer célula, incluindo linfócitos oriundos de amostras de sangue periférico, fibroblastos da pele ou amniócitos. Todavia, os diversos têm que ser discutidos antes de introduzir o teste nos laboratórios clínicos como um diagnóstico de rotina ou um teste pré-sintomático.

A interpretação do teste precisa de ser rigorosamente testada para definir a sensibilidade e a especificidade dos diagnósticos. Para indivíduos com o questionável diagnóstico da NF1, a aplicabilidade do teste para mutações NF1, tem que ser ainda estabelecida. A aplicabilidade clínica do ensaio é frequentemente limitada a indivíduos com um diagnóstico clínico de NF1 estabelecido, uma vez que estes são o único grupo de pacientes que têm vindo a ser estudados até agora. Há necessidade de estudar vastos grupos de pacientes, com os sintomas clínicos bem definidos, a fim de determinar a taxa de detecção que possam ser aplicadas. Até que mais investigação seja feita, os resultados laboratoriais negativos serão muito difíceis de interpretar e os resultados positivos terão um valor prognóstico desconhecido, nos pacientes sem um diagnóstico clínico de NF1.

Os aspectos de controlo analítico e quantitativo do ensaio têm que ficar estabelecidos, incluindo sensibilidade analítica, especificidade analítica, interferências (por exemplo, contaminação maternal do fluido amniótico) e conveniente contolo de qualidade da amostra (importante porque esta técnica é, embora raramente, susceptível a bandas estranhas vindas de múltiplas fontes, nenhuma das quais examinada rigorosamente). Até que estes parâmetros estejam estabelecidos numa maior amostra de pacientes, superior à dos 21 que foram descritos, sugere-se que a única abordagem responsável ao uso do teste no âmbito clínico será verificar cada uma das proteínas truncadas, através da sequência genómica para a mutação correspondente.

O uso, mais imediato e significativo, do teste é como teste laboratorial, indiferentemente da sua sensibilidade e utilizado nas famílias com NF1. Uma vez que a mutação tem vindo a ser identificada em indívíduos afectados (segundo od critérios clínicos estabelecidos pelo NIH para a NF1), todos os afectados e membros pré-sintomaáticos dessa mesma família , espera-se que sejam heterozigoticos para essa mesma mutação. O teste pode ser vantajoso quando irmãos ou crianças de um indivíduo afectado podem, eles próprios, ter NF1, mas um diagnóstico clínico dafinitivo não pode ser feito com certeza durante a infância.

Os testes laboratoriais positivos ou negaticos poderiam por um lado estabelecer ou pôr de parte um diagnóstico da NF1 nestes parentes, efectivamente estabelecendo ou eliminando a necessidade do seu emprego apropriado.

A aplicação do teste do truncamento da proteína identificada no gene NF1 é excitante para ambos: clínicos e investigadores e está apto a ter um impacto nos NF1 e na comunidade médica genética.

Até ao presente o diagnóstico feito pelo teste acenta na confirmação do diagnóstico clínico da NF1 e subsequentemente identificando os parentes portadores da mesma mutação NF1. Contudo, até neste grupo seleccionado de pacientes, a utilidade do teste pode ser imprevisível a não ser que as mutações sejam verificadas pela sequência genómica. Sugere-se que o diagnóstico pré-natal seja abordado com extrema precaução, como acontece com qualquer teste ainda a ser desenvolvido para uso clínico, os casos pré-natal devem ser seleccionados cuidadosamente tendo em atenção o valor prognóstico do teste. Também se sugere que o aconselhamento genético seja facultado para qualquer pessoa que esteja a ser testada para que as limitações do actuais do teste sejam claramente compreendidas.

Suzuki D.T. et al; Introdução à Genetica, 4ª edição; Editora Guanabara Koogan, 1992.